روش های مختلف در تکنیک PCR

pcr چیست؟

PCR یک روش تکثیر DNA در آزمایشگاه است. PCR مخفف Polymerase Chain Reaction یا واکنش زنجیره ای پلیمراز است. در این روش، DNA هدف را با استفاده از یک آنزیم به نام  DNAپلیمراز، تکثیر میکنند. PCR چند مرحله دارد که به شرح زیر است:

•  مرحله اول: دناتوراسیون. در این مرحله، DNA هدف را در دمای بالایی (حدود ۹۵ درجه سانتی گراد) قرار میدهند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند.

•  مرحله دوم: انلینگ. در این مرحله، دو عدد پرایمر (کوتاه ترین قطعات DNA) که با قسمت های ابتدایی و انتهایی DNA هدف همخوانی دارند، را به واکنش اضافه میکنند. پرایمرها در دمای پایین تر (حدود ۵۵ درجه سانتیگراد) به رشته های DNA هدف متصل میشوند و نقطه شروع برای تکثیر را تعیین میکنند.

•  مرحله سوم: الانگیشن یا طویل سازی. در این مرحله، آنزیم پلیمراز DNA را به واکنش اضافه میکنند. این آنزیم در دمای متوسط (حدود ۷۲ درجه سانتیگراد) شروع به ساخت رشته جدید DNA میکند که با رشته اصلی DNA همخوانی دارد. این کار باعث تولید دو عدد DNA جدید میشود که هر کدام شامل یک رشته قالب و یک رشته جدید هستند.

این سه مرحله را چندین بار (حدود ۳۰ تا ۴۰ بار) تکرار می شود تا تعداد DNA هدف به صورت نمایی افزایش یابد. PCR کاربردهای مختلفی دارد، که شامل شناسایی و تعیین توالی ژن ها، تشخیص عفونت ها و بیماری های وراثتی، بررسی پروفایل DNA و تعیین نسبت خانوادگی و غیره می باشد.

انواع مختلف PCR

Hot start PCR

Hot start PCR یک روش تغییر یافته از واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR)) است که باعث کاهش محصولات ناخواسته و دایمر پرایمر به دلیل تضعیف DNA غیر اختصاصی در دمای اتاق (یا سردتر) می شود. این روش با جلوگیری از فعالیت DNA  پلیمراز در دمای پایین، احتمال برهم کنش های غیر اختصاصی را کاهش می دهد و باعث افزایش عملکرد و دقت PCR می شود. برای انجام hot start PCR، برخی از مواد واکنش ها یا همان مسترمیکس تا زمانی که ریکشن به دمای خاص تثبیت شده گرم شود، جدا نگه داشته می شوند. این کار باعث کاهش زمان تثبیت و در نتیجه کاهش احتمال تضعیف DNA غیر اختصاصی و تاثیر برهم کنش غیر اختصاصی پرایمر قبل از تجزیه می شود.

اختلاف hot start PCR با روش های دیگر

اختلاف hot start PCR با روش های دیگر در این است که در hot start PCR، فعالیت پلیمراز DNA یا ادغام dNTP های تغییر یافته در طول تنظیم واکنش تا زمانی که یک مرحله فعال سازی حرارتی رخ دهد، مهار یا کنترل می شود. این کار باعث می شود که در دمای اتاق، تضعیف DNA غیر اختصاصی و تشکیل دایمر پرایمر جلوگیری شود. در PCR سنتی، محصول واکنش در دمای اتاق ساخته و انجام می شود و به دلیل فعال بودن پلیمراز DNA، پرایمر ها ممکن است دایمر پرایمر بسازند یا به DNA غیر اختصاصی بچسبند.

در طول روند PCR، DNA  پلیمراز هر قطعه DNA را که پرایمر به آن بسته است، توسعه می دهد و علاوه بر محصولات هدف، محصولات غیر اختصاصی را نیز تولید می کند که باعث کاهش عملکرد و بازده می شود. در hot start PCR، بعضی از واکنش ها تا زمانی که مخلوط به دمای خاص تثبیت شده گرم شود، جدا نگه داشته می شوند. این کار باعث کاهش زمان تثبیت و در نتیجه کاهش احتمال تضعیف DNA غیر اختصاصی و تاثیر برهم خوردن غیر اختصاصی پرایمر قبل از تجزیه می شود.

touchdown PCR

•  touchdown PCR یک نوع خاص از PCR است که شامل تغییر دمای آنلینگ در طول چرخه های PCR است. در این روش، ابتدا دمای انلینگ را بالاتر از دمای بهینه پرایمرها قرار میدهند تا فقط پرایمرهایی که با DNA هدف همخوانی کامل دارند متصل شوند. سپس دما را به تدریج کاهش میدهند تا پرایمرهایی که با DNA هدف همخوانی نسبی دارند متصل شوند. touchdown PCR میتواند برای افزایش دقت و کاهش خطای PCR، جلوگیری از تکثیر DNA های غیر هدف و تداخل بین پرایمرها و افزایش بازده PCR مورد استفاده قرار گیرد.

 touchdown PCR کاربردهای مختلفی دارد، مانند شناسایی و تعیین توالی ژنهای دارای تکرارها یا تغییرات نقطه ای، تشخیص عفونتها و بیماری های وراثتی با حساسیت بالا، بررسی پروفایل DNA و تعیین نسبت خانوادگی با دقت بالا و تولید آمپلیکون های مناسب برای کلونینگ ژن.

روش اجرای touchdown PCR به شرح زیر است:

•  مرحله اول: آماده سازی محلول. در این مرحله، شما باید مقادیر مناسب و کافی از DNA هدف، پرایمرها، پلیمراز DNA، محلول بافر، دکستروز و نوکلئوتیدها را در یک میکروتیوب قرار دهید و آن را مخلوط کنید. سپس میکروتیوب را در دستگاه PCR قرار دهید.

•  مرحله دوم: اجرای چرخه ها. در این مرحله، شما باید تعداد و شرایط چرخه های touchdown PCR را برای دستگاه PCR تنظیم کنید.

•  مرحله سوم: بررسی نتایج.  در این مرحله، شما باید نمونه های خروجی touchdown PCR را با استفاده از الکتروفورز جداسازی و مشاهده کنید. برای این کار، شما باید نمونه های خروجی touchdown PCR را در ژل مناسب قرار داده و یک جریان الکتریکی از طرفین ژل عبور داده و سپس ژل را با استفاده از روش رنگ آمیزی مناسب رنگ کنید. با این کار، شما میتوانید ببینید که DNA های تکثیر شده چه سایزی دارند و باند اختصاصی شما هستند یا خیر.

multiplex PCR

•  multiplex PCR یک نوع خاصی از PCR است که از دو یا چندین جفت پرایمر در یک واکنش PCR استفاده می شود. در این روش، چندین DNA هدف را با استفاده از پلیمراز DNA، پرایمرهای مختلف و نوکلئوتیدها تکثیر میکنند. multiplex PCR میتواند برای تعیین حضور و غلظت چندین DNA هدف در یک نمونه، کاهش هزینه و زمان آزمایش و افزایش حساسیت و دقت آزمایش مورد استفاده قرار گیرد.

روش اجرای multiplex PCR به شرح زیر است:

•  مرحله اول: آماده سازی محلول. multiplex PCR  در این مرحله، شما باید مقادیر مناسب و کافی از DNA هدف، پرایمرهای مختلف، پلیمراز DNA، محلول بافر را در یک میکروتیوب PCR قرار دهید و آن را مخلوط کنید. سپس میکروتیوب PCR را در دستگاه PCR یا ترمال سایکلر قرار دهید.

•  مرحله دوم: اجرای چرخه های. multiplex PCR  در این مرحله، شما باید تعداد و شرایط چرخه های multiplex PCR را برای ترموسایکلر PCR (مراحل مشابه تکنیکPCR ) تنظیم کنید. هر چرخه شامل سه سیکل زیر است:

سیکل اول: دناتوره شدن. در این مرحله، دستگاه PCR دمای محلول multiplex PCR را به حدود ۹۵ درجه سانتیگراد افزایش میدهد تا دو رشته DNA هدف از هم جدا شوند.

  سیکل دوم: انلینگ. در این مرحله، دستگاه PCR دمای محلول multiplex PCR را به حدود ۵۵ درجه سانتیگراد کاهش میدهد تا پرایمرهای مختلف به رشته های DNA هدف متصل شوند و نقطه شروع برای تکثیر را تعیین کنند.

  سیکل سوم: الانگیشن. در این مرحله، دستگاه PCR دمای محلول multiplex PCR را به حدود ۷۲ درجه سانتیگراد افزایش میدهد تا پلیمراز DNA شروع به ساخت رشته جدید DNA کند که با رشته قالب DNA همخوانی دارد. این کار باعث تولید چندین DNA جدید میشود که هر کدام شامل یک رشته قالب و یک رشته جدید هستند.

•  مرحله سوم: بررسی نتایج . در این مرحله، شما باید نمونه های خروجی multiplex PCR را با استفاده از الکتروفورز جداسازی و مشاهده کنید. برای این کار، شما باید نمونه های خروجی multiplex PCR را در ژل مناسب قرار داده و یک جریان الکتریکی از طرفین ژل عبور داده و سپس ژل را رنگ کنید. با این کار، شما میتوانید ببینید که DNA های تکثیر شده شامل چه سایزهایی هستند.

کلام آخر:

 در این مقاله در مورد دستگاه pcr و کاربرد های آن صحبت کردیم و سعی کردیم شمارا با این دستگاه آشنا کنیم، هم چنین یک سایتی برای شما دوستان پیدا کردیم که مرجع فروش این دستگاه ها در ایران هستند، شرکت ماناتک